科研产出
海稻86转录因子HD-ZIP的克隆及表达分析
《山东农业科学 》 2024
摘要：同源结构域亮氨酸拉链(HD-ZIP)转录因子是植物独有的转录因子，分为四个不同的亚家族(HD-ZIPⅠ～Ⅳ),其中HD-ZIPⅠ在植物发育过程的调控、信号网络和对环境胁迫的反应中发挥关键作用。海稻86是一种耐盐碱能力较高的特异水稻种质资源。为解析HD-ZIPⅠ在盐胁迫应答过程中的功能，本研究以海稻86为材料，利用RT-PCR技术克隆了一个HD-ZIPⅠ基因，命名为OsHDZ1,并对其进行生物信息学分析、亚细胞定位及盐胁迫下表达分析。结果表明，OsHDZ1基因的CDS序列全长831 bp,编码276个氨基酸，蛋白分子量为30.65 kDa,理论等电点为5.19,为亲水性不稳定蛋白；OsHDZ1蛋白不含跨膜结构，含有25个磷酸化位点，二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲组成；同源性分析发现该蛋白序列与禾本科植物弯叶画眉草和小麦具有较高的亲缘关系；对OsHDZ1启动子元件预测发现其具有脱落酸、茉莉酸等激素响应元件，同时具有环境胁迫等响应元件；细胞定位分析显示该蛋白定位于细胞核。荧光定量PCR结果发现，在盐胁迫处理下，OsHDZ1表达量整体呈上升，在60 h之前逐渐上升，在60 h达到最高，在72 h表达量下降，表明该基因可能在海稻耐盐性中具有调控功能。本研究结果可为后续深入解析OsHDZ1基因调控海稻耐盐的功能奠定基础，为培育耐盐作物提供基因资源。
关键词： 海稻86 HD-ZIPⅠ 基因克隆 生物信息学 亚细胞定位 表达分析
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基于病毒诱导的基因沉默(VIGS)方法的LsRGL1基因在生菜中的功能分析
《湖南农业大学学报(自然科学版) 》 2024 北大核心 CSCD
摘要：为了确定LsRGL1基因对生菜抽薹的影响，以S39生菜品种为试验材料，通过逆转录聚合酶链反应(RT–PCR)从S39生菜品种中克隆得到LsRGL1基因；采用病毒诱导基因沉默(VIGS)方法，利用烟草脆裂病毒(TRV)载体对目的基因进行沉默；采用表型观察、石蜡切片、实时荧光定量PCR(qPCR)方法、酶联免疫吸附法(ELISA)分别研究空白对照组(无TRV载体)、阴性对照组(按质量比1∶1同时注射TRV1空载体和TRV2空载体)和试验组(按质量比1∶1同时注射TRV1空载体和TRV2–LsRGL1重组载体)中植株表型、花芽分化、LsRGL1基因的相对表达量和内源激素质量分数的变化。结果表明：病毒侵染后，试验组植株的茎长相对于空白对照组和阴性对照组的茎长明显增大，且试验组各项表型数据均大于2个对照组的表型数据，而空白对照组与阴性对照组各项表型数据之间并未出现明显差异；石蜡切片结果表明试验组植株已经开始花芽分化，相较于对照组提前进入生殖生长时期；q PCR分析结果显示，试验组中LsRGL1基因的相对表达量相较于空白组和阴性对照组的显著下调，且下调幅度均超过50%。试验组中内源激素赤霉素(GA3)、脱落酸(ABA)、生长素(IAA)的含量显著高于对照组的含量，而茉莉酸(JA)含量显著下降。综上可知，沉默LsRGL1基因加快了生菜的抽薹。
关键词： 生菜 表达分析 内源激素 病毒诱导的基因沉默(VIGS)
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芸薹属植物MYBL2基因的克隆及其在A、B、C基因组中的PCR鉴别
《中国农业科学 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：【目的】MYBL2负调控拟南芥花青素和原花青素的生物合成。从芸薹属6个物种的不同叶色材料中克隆MYBL2基因，分析其序列和表达模式，探究其在芸薹属植物花青素生物合成途径中的功能，为油菜的品质、抗逆性、观赏性等性状改良提供参考。【方法】以芸薹属6个物种19份供试材料的总DNA为模板，同源克隆MYBL2基因，并进行多序列比对和进化树分析；对白菜、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥的紫叶材料进行遮光处理，结合转录组和qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平；对甘蓝、甘蓝型油菜、芥菜型油菜以及埃塞俄比亚芥紫、绿叶材料进行qRT-PCR分析MYBL2基因表达水平；根据克隆MYBL2-1和MYBL2-2序列的核苷酸变异位点设计特异性引物，开发能够区分MYBL2基因组来源的PCR标记。【结果】克隆获得MYBL2-1和MYBL2-2各9个同源基因共56个拷贝。其中，BcaMYBL2-1为首次获得，BcaMYBL2-1编码区序列全长为867 bp，包含2个内含子，分别为168和102 bp，编码198个氨基酸，分子量为22.69 kD，等电点（pI）为8.72。序列比对和进化分析表明，BcaMYBL2-1来源于B基因组。芸薹属6个物种MYBL2-1和MYBL2-2同源基因中，仅BraA07.MYBL2-1、BolC06.MYBL2-1和BcaMYBL2-1在不同叶色材料中存在序列差异。经遮光处理后，紫叶材料叶色变浅，在白菜紫宝5号中，BraA07.MYBL2-1和BraA02.MYBL2-2表达量分别为未遮光部分的0.7和0.4倍；在紫叶白花甘蓝型油菜中，BnaA07.MYBL2-1、BnaC06.MYBL2-1、BnaA02.MYBL2-2和BnaC02.MYBL2-2表达量分别为未遮光部分的0.4、0.5、0.4和0.4倍；在紫叶芥中，BjuA07.MYBL2-1、BjuB03.MYBL2-1、BjuA02.MYBL2-2和BjuB05.MYBL2-2表达量分别为未遮光部分的0.4、0.3、0.4和0.2倍；在紫秆埃芥中，BcaMYBL2-1、BcaB03.MYBL2-1和BcaC03.MYBL2-2表达量分别为未遮光部分的0.3、0.4和0.5倍，而BcaB05.MYBL2-2表达量为未遮光部分的2.4倍。对比芸薹属不同叶色材料MYBL2基因表达情况，结果表明，除了羽衣甘蓝，在紫叶材料中MYBL2基因大部分同源基因的表达量均高于绿叶。在羽衣甘蓝中，绿叶羽衣甘蓝BolC06.MYBL2-1和BolC02.MYBL2-2的表达量分别为紫叶羽衣甘蓝的2.5和3.5倍；在甘蓝型油菜中，紫叶白花BnaA07.MYBL2-1、BnaC06.MYBL2-1和BnaC02.MYBL2-2的表达量分别为绿叶白花的7.5、8.6和26.0倍，而绿叶白花BnaA02.MYBL2-2的表达量为紫叶白花的13.0倍；在芥菜型油菜中，紫叶芥BjuA07.MYBL2-1、BjuB03.MYBL2-1、BjuA02.MYBL2-2和BjuB05.MYBL2-2的表达量分别为四川黄籽的8.3、11.8、23.2和14.6倍；在埃塞俄比亚芥中，紫秆埃芥BcaMYBL2-1、BcaB03.MYBL2-1的表达量分别为W-BCDH76的7.1和27.6倍，而W-BCDH76的BcaB05.MYBL2-2和BcaC03.MYBL2-2的表达量则分别为紫秆埃芥的2.8和5.0倍。依据克隆的基因序列设计出5对引物，可以有效鉴别芸薹属植物MYBL2基因的A、B、C基因组来源。【结论】芸薹属紫叶材料MYBL2基因的表达与光照密切相关，而且参与花青素生物合成的调控机制与拟南芥MYBL2负调控花青素生物合成的机制有所不同。
关键词： 芸薹属植物 MYBL2基因 同源克隆 基因表达 基因组PCR鉴别
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亚致死浓度的双苯唑酸对斑马鱼胚胎生长发育的影响
《农药 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：[目的]双苯唑酸是一种除草剂安全剂,可缓解禾草灵对水稻和玉米的药害作用,扩大其在水田的使用,应评估双苯唑酸对水生生物的毒性.[方法]研究双苯唑酸对斑马鱼胚胎的急性毒性、生长发育的影响及影响生长发育的机理.[结果]双苯唑酸对斑马鱼的LC50值在48、96 h,分别为1.81、1.66 mg/L.斑马鱼胚胎暴露于0.01、0.1 mg/L的双苯唑酸,胚胎孵化时间延长,幼鱼体内SOD(超氧化物歧化酶)、CAT(过氧化氢酶)、MDA(丙二醛)、ALDH(乙醛脱氢酶)、GSH(还原型谷胱甘肽)活性增加,gstp2、cat、bcl2表达量增加,Cu/Zn-sod、Mn-sod和bax表达量减少.[结论]双苯唑酸对斑马鱼胚胎的毒性为中毒,胚胎可以通过体内相关基因表达量的变化改变氧化应激酶活性进行解毒.
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稻瘟病菌坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的原核表达、纯化与活性分析
《科学通报 》 2023 EI 北大核心 CSCD
摘要：坏死和乙烯诱导肽1(necrosis and ethylene-inducing peptide 1,Nep1)样蛋白(Nep1-like proteins,NLPs)是一类广泛存在于细菌、真菌及卵菌中的分泌型蛋白.本研究通过生物信息学分析了稻瘟病菌中的4个坏死和乙烯诱导肽1样蛋白的家族基因成员的相关信息,克隆了它们的编码区序列,分别将它们构建到了pGEX-6P-l载体中.通过优化诱导条件对它们进行了原核表达、纯化,获得了相应的可溶性目的蛋白,进一步将纯化的目的蛋白注射到烟草叶片中,发现N端融合GST标签的MoNLP1、MoNLP4蛋白仍具有生物学活性,可以明显诱发烟草叶片组织产生细胞坏死.该研究为进一步深入研究该基因家族在稻瘟病菌中的功能与作用以及开发更多潜在的植物蛋白激发子奠定基础.
关键词： 稻瘟病 坏死和乙烯诱导肽1样蛋白 原核表达 蛋白纯化 细胞坏死
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辐射诱变冰糖橙早熟突变体的遗传鉴定与品种特性
《核农学报 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：为探究辐射诱变冰糖橙果实提早着色性状的遗传变异,果实着色与糖酸内在品质表现,以及辐射诱变冰糖橙是否为早熟突变体,以突变体与对照冰糖橙为材料,对比分析春梢长度、春梢叶片、花器官、果实大小、果皮颜色转变、主要物候期等性状和特性的变化,应用分子标记鉴定遗传变异,比较两者果实中可溶性固形物、可滴定酸、固酸比的变化以及蔗糖和柠檬酸代谢相关基因的表达.结果表明,与对照冰糖橙相比,突变体春梢显著变短,成熟时果实较大,果皮和果肉提前15 d转色成橙黄色和橙色,主要物候期提早2~5d,插入或缺失(InDel)标记和简单序列重复(SSR)标记引物扩增都存在差异条带,突变体发生了遗传改变.早熟突变体果实外观颜色与内在品质在花后190d同步达到正常成熟度,可溶性固形物、可滴定酸及固酸比分别为14.53°Brix、0.46%和31.59,表现为低酸、降酸早、固酸比值高,比对照提早15 d成熟.蔗糖和柠檬酸的合成、降解、转运相关基因的表达分析结果表明,早熟突变体蔗糖合成多、转运早,柠檬酸合成少、降解快、贮运少,与果实品质表现低酸、降酸早、固酸比高基本吻合.综上,辐射诱变突变体发生了植物性状、生物特性、DNA的遗传改变,果实降酸早、含酸低、固酸比高,11月上旬着色成熟.研究结果为该突变体的进一步选育和登记早熟冰糖橙新品种奠定了基础.
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辣椒CAMTA基因家族生物信息学分析
《中国蔬菜 》 2022 北大核心
摘要：为了解辣椒中CAMTA基因家族生物信息学功能,探究其在非生物胁迫下的基因表达规律,进而为辣椒CAMTA基因的功能开发与抗逆育种提供基础,在PlantTFDB网站得到辣椒CAMTA家族成员,并对其基因结构、结构域、蛋白质三级结构、系统进化关系、顺式作用元件、激素处理与非生物胁迫表达情况进行分析.结果表明,在辣椒中有5个CAMTA家族成员,均包含CG-1保守结构域;主要分布在4条染色体上,其基因大小差异明显,氨基酸数目在89~1023个之间,外显子数目为1~13个.进化树分析表明,辣椒CAMTA基因家族可以分为3类,辣椒CAMTA的氨基酸序列与番茄CAMTA的氨基酸序列亲缘关系最近.基因表达量分析表明,辣椒CAMTA基因家族在胁迫后的信号转导和组织发育过程中发挥了作用.
关键词： 辣椒 CAMTA基因家族 生物信息学分析 胁迫 表达分析
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烟草花叶病毒P54基因的原核表达与蛋白纯化
《福建农业学报 》 2021 CSCD
摘要：【目的】烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）编码的与复制相关通读P183基因中,编码一个P54基因,其功能及其作用分子机制还鲜见报道。为获得P54蛋白纯化样品开展本研究,以期为P54蛋白的功能及其作用分子机制研究奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术,从感染TMV的三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）cDNA中扩增获得片段大小为1 425 bp的烟草花叶病毒P54基因,并克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1,转化E coli BL21（DE3）中进行诱导表达,包涵体透析复性后采用Ni-NTA柱层析纯化,Western-blotting进行鉴定。【结果】原核表达的TMV P54蛋白,主要以包涵体的形式存在;复性后经Ni-NTA柱层析纯化,SDS-PAGE表明纯化蛋白为一分子量约为60 kDa的单一条带。Western-blotting结果证实纯化蛋白为P54重组蛋白。【结论】本研究纯化得到了重组P54蛋白,为进一步深入研究P54蛋白的功能奠定基础。
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柑橘香橙素生成途径关键酶黄烷酮-3-羟化酶特性分析及原核表达
《食品科学技术学报 》 2021
摘要：香橙素是柑橘类黄酮的重要组成,黄烷酮-3-羟化酶是香橙素生成途径中的关键作用酶。对黄烷酮-3-羟化酶的特点进行总结与分析并在大肠杆菌中进行表达。首先从NCBI数据库筛选了来自柑橘、陆地棉、玉米、水母雪莲和欧芹的5种f3h,对其进行理化性质、蛋白质二三级结构、序列比对等生物信息学分析并以大肠杆菌为宿主进行表达。发现5种来源的f3h,其基因开放阅读框为1 032～1 119 bp,编码343～372个氨基酸,蛋白分子质量为38.89～41.45 kDa,理论等电点在5.43～5.96,且不同物种F3H的理化性质、结构域和蛋白质结构也有一定的相似性。通过构建大肠杆菌表达体系发现:黄烷酮-3-羟化酶均能进行原核表达,除去来源于水母雪莲的F3H未检测到香橙素的生成,其余4种F3H均能将柚皮素转化为香橙素且产物生成量不同,其中ZmF3H生成量最高达20.12mg/L。
关键词： 柑橘 黄烷酮-3-羟化酶 生成途径 特征分析 原核表达
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可视化细胞色素b5蛋白的显色核心片段解析
《南京农业大学学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：[目的]本文旨在明确含Cyt-b5类血红素/类固醇结合结构域(Cyt-b5 D)显色片段的最佳长度及其与原核表达载体的普适性,并筛出有效的可视化标签,以期提高载体构建的效率和便捷性.[方法]分析二化螟Cyt-b5蛋白结构域,将其划分成含Cyt-b5 D的不同长度片段(OA、OB、OC等),并分别与3种原核表达载体pET-28a(+)、pET-41a(+)和pET-30a(+)进行连接和异源表达;将筛选的显色片段与二化螟RDL1基因融合表达,比较不同表达时间菌液的显色反应和吸光值;用亲和层析法纯化显色片段表达以及与RDL1表达的融合蛋白,然后进行Western blot检测.[结果]OA片段是最佳的显色片段,在3种原核表达载体中均可表达出红色的蛋白,且与RDL1融合表达时显色稳定,表明其具有普适性.在420 nm波长下的特征吸收峰可用于实时监测显色菌液的生长状态,而层析柱中的红色变化可用于判断蛋白纯化过程.此外,利用Western blot可检测到目的蛋白,表明显色片段的存在并未干扰目的蛋白的准确鉴定.[结论]Cyt-b5显色片段(OA)可作为原核表达系统的可视化标签,为蛋白表达和纯化等试验操作提供指示标记,从而提高其操作的便捷性和时效性.
关键词： 细胞色素b5 载体构建 原核表达 Westernblot 可视化标签
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