科研产出
可视化细胞色素b5蛋白的显色核心片段解析
《南京农业大学学报 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：[目的]本文旨在明确含Cyt-b5类血红素/类固醇结合结构域(Cyt-b5 D)显色片段的最佳长度及其与原核表达载体的普适性,并筛出有效的可视化标签,以期提高载体构建的效率和便捷性.[方法]分析二化螟Cyt-b5蛋白结构域,将其划分成含Cyt-b5 D的不同长度片段(OA、OB、OC等),并分别与3种原核表达载体pET-28a(+)、pET-41a(+)和pET-30a(+)进行连接和异源表达;将筛选的显色片段与二化螟RDL1基因融合表达,比较不同表达时间菌液的显色反应和吸光值;用亲和层析法纯化显色片段表达以及与RDL1表达的融合蛋白,然后进行Western blot检测.[结果]OA片段是最佳的显色片段,在3种原核表达载体中均可表达出红色的蛋白,且与RDL1融合表达时显色稳定,表明其具有普适性.在420 nm波长下的特征吸收峰可用于实时监测显色菌液的生长状态,而层析柱中的红色变化可用于判断蛋白纯化过程.此外,利用Western blot可检测到目的蛋白,表明显色片段的存在并未干扰目的蛋白的准确鉴定.[结论]Cyt-b5显色片段(OA)可作为原核表达系统的可视化标签,为蛋白表达和纯化等试验操作提供指示标记,从而提高其操作的便捷性和时效性.
关键词： 细胞色素b5 载体构建 原核表达 Westernblot 可视化标签
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柑橘香橙素生成途径关键酶黄烷酮-3-羟化酶特性分析及原核表达
《食品科学技术学报 》 2021
摘要：香橙素是柑橘类黄酮的重要组成,黄烷酮-3-羟化酶是香橙素生成途径中的关键作用酶。对黄烷酮-3-羟化酶的特点进行总结与分析并在大肠杆菌中进行表达。首先从NCBI数据库筛选了来自柑橘、陆地棉、玉米、水母雪莲和欧芹的5种f3h,对其进行理化性质、蛋白质二三级结构、序列比对等生物信息学分析并以大肠杆菌为宿主进行表达。发现5种来源的f3h,其基因开放阅读框为1 032～1 119 bp,编码343～372个氨基酸,蛋白分子质量为38.89～41.45 kDa,理论等电点在5.43～5.96,且不同物种F3H的理化性质、结构域和蛋白质结构也有一定的相似性。通过构建大肠杆菌表达体系发现:黄烷酮-3-羟化酶均能进行原核表达,除去来源于水母雪莲的F3H未检测到香橙素的生成,其余4种F3H均能将柚皮素转化为香橙素且产物生成量不同,其中ZmF3H生成量最高达20.12mg/L。
关键词： 柑橘 黄烷酮-3-羟化酶 生成途径 特征分析 原核表达
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烟草花叶病毒P54基因的原核表达与蛋白纯化
《福建农业学报 》 2021 CSCD
摘要：【目的】烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus,TMV）编码的与复制相关通读P183基因中,编码一个P54基因,其功能及其作用分子机制还鲜见报道。为获得P54蛋白纯化样品开展本研究,以期为P54蛋白的功能及其作用分子机制研究奠定基础。【方法】采用RT-PCR技术,从感染TMV的三生烟（Nicotiana tabacum var. Samsun NN）cDNA中扩增获得片段大小为1 425 bp的烟草花叶病毒P54基因,并克隆到原核表达载体pEASY-Blunt E1,转化E coli BL21（DE3）中进行诱导表达,包涵体透析复性后采用Ni-NTA柱层析纯化,Western-blotting进行鉴定。【结果】原核表达的TMV P54蛋白,主要以包涵体的形式存在;复性后经Ni-NTA柱层析纯化,SDS-PAGE表明纯化蛋白为一分子量约为60 kDa的单一条带。Western-blotting结果证实纯化蛋白为P54重组蛋白。【结论】本研究纯化得到了重组P54蛋白,为进一步深入研究P54蛋白的功能奠定基础。
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水稻Os4CL5的Val337缺失突变激活其芥子酸催化活性
《农业生物技术学报 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)催化各种羟基肉桂酸生成相应的硫酯,从而调控木质素和黄酮类物质的生成。4CL的芥子酸催化活性一直是备受关注的一个问题,目前只有拟南芥(Arabidopsis thaliana)的At4CL4和大豆(Glycine max)的Gm4CL1具有芥子酸转化能力。本研究用水稻(Oryza sativa subsp.japonica)苗期的叶片为材料,提取总RNA并以此为模板,用反转录PCR扩增水稻的Os4CL5基因,并将其连接到原核表达载体p ET22-b(+)上,构建了原核表达载体p ET-4CL5(+Val)。通过定点突变的方法删除了水稻Os4CL5的Val337,构建了原核表达载体p ET-4CL5(-Val)。重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(ED3)并经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测表明,融合蛋白的分子量为57.0 k D,与预测值一致。His-Spin Trap蛋白纯化系统纯化回收重组蛋白,然后对重组蛋白的酶学性质进行表征。结果表明,野生型Os4CL5对不同底物表现出了不同的催化效率,香豆酸是最适底物,其次是阿魏酸,再次是咖啡酸,对芥子酸没有活性。与野生型Os4CL5相比,突变型Os4CL5对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸的催化效率有所提高,并且其底物特异性发生了明显改变,获得了对芥子酸的催化活性。本研究为利用基因工程手段调控木质素的生物合成提供了理论依据。
关键词： 水稻 4-香豆酸:辅酶A连接酶 原核表达 酶活性
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水稻CSN5B蛋白抗血清的制备及其应用
《生物技术通讯 》 2016
摘要：目的:克隆水稻COP9信号复合物5B亚基(CSN5B)的基因,原核表达CSN5B蛋白并制备多克隆抗体。方法:用RT-PCR技术从日本晴水稻中扩增得到CSN5B蛋白基因Os CSN5B并将其连接至p EASYTM-T5 Zero克隆载体,然后将其亚克隆至原核表达载体p ET-32a+,并导入大肠杆菌BL21plys S宿主菌中诱导表达;重组的CSN5B融合蛋白经Ni-NTA His.Bind Resin纯化后免疫兔子制备多克隆抗体,并经Western印迹分析。结果与结论:获得了CSN5B蛋白的特异性抗体,Western印迹显示CSN5B蛋白在水稻植株中呈高水平表达,为进一步探讨该基因的功能奠定了基础。
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水稻叶绿体基因组定点表达载体的构建及增强型绿色荧光蛋白原核表达分析
《杂交水稻 》 2011 北大核心 CSCD
摘要：分别克隆了水稻叶绿体基因组同源重组片段trnI和trnA、具有3种不同核糖体结合位点(RBS)序列的增强型绿色荧光蛋白基因(egfp)、来自烟草叶绿体的16S rRNA基因启动子Prrn和psbA基因终止子TpsbA,将上述元件通过酶切位点依次连接到质粒pUC19上,构建了3种能编码增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的水稻叶绿体基因组定点整合表达载体pIA-EGFP1、pIA-EGFP2和pIA-EGFP3。进行分子检测验证后,对上述载体进行了大肠杆菌EGFP原核表达检测,结果携带来源于λ噬菌体T7基因10的5'端非翻译区的载体pIA-EGFP3荧光最强,适合用于水稻叶绿体转化。
关键词： 水稻 叶绿体表达载体 原核表达 增强型绿色荧光蛋白(EGFP)
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