文献类型： 中文期刊
作者： 罗兵 1 ; 赵敏欢 1 ; 李朋朋 1 ; 杨志刚 1 ;
作者机构： 1.常熟理工学院生物与食品工程学院
关键词： 水稻;4-香豆酸:辅酶A连接酶;原核表达;酶活性
期刊名称： 农业生物技术学报
ISSN： 1674-7968
年卷期： 2016 年 24 卷 09 期
页码： 1312-1318
收录情况： 北大核心 ; CSCD
摘要： 4-香豆酸辅酶A连接酶(4-coumarate:coenzyme A ligase,4CL)催化各种羟基肉桂酸生成相应的硫酯,从而调控木质素和黄酮类物质的生成。4CL的芥子酸催化活性一直是备受关注的一个问题,目前只有拟南芥(Arabidopsis thaliana)的At4CL4和大豆(Glycine max)的Gm4CL1具有芥子酸转化能力。本研究用水稻(Oryza sativa subsp.japonica)苗期的叶片为材料,提取总RNA并以此为模板,用反转录PCR扩增水稻的Os4CL5基因,并将其连接到原核表达载体p ET22-b(+)上,构建了原核表达载体p ET-4CL5(+Val)。通过定点突变的方法删除了水稻Os4CL5的Val337,构建了原核表达载体p ET-4CL5(-Val)。重组质粒转化大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(ED3)并经异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-d-thiogalactoside,IPTG)诱导表达,十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE)检测表明,融合蛋白的分子量为57.0 k D,与预测值一致。His-Spin Trap蛋白纯化系统纯化回收重组蛋白,然后对重组蛋白的酶学性质进行表征。结果表明,野生型Os4CL5对不同底物表现出了不同的催化效率,香豆酸是最适底物,其次是阿魏酸,再次是咖啡酸,对芥子酸没有活性。与野生型Os4CL5相比,突变型Os4CL5对香豆酸、咖啡酸和阿魏酸的催化效率有所提高,并且其底物特异性发生了明显改变,获得了对芥子酸的催化活性。本研究为利用基因工程手段调控木质素的生物合成提供了理论依据。
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