科研产出
利用酵母双杂交系统筛选水稻中与OsCRK5互作蛋白
《生物技术通报 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：水稻是重要的粮食作物，研究水稻生长发育调控机制可为水稻品种改良奠定理论基础。钙依赖蛋白激酶（calcium dependent protein kinases, CDPKs）是植物中重要的蛋白激酶，参与植物生长发育以及对环境反应的应答。水稻中的CRK5（CDPKrelated kinase 5）在蛋白序列和结构上与CDPK高度同源。为进一步研究OsCRK5在水稻干旱反应中的功能，本研究利用酵母双杂交筛库技术筛选了OsCRK5的互作蛋白。首先将OsCRK5的1-1 332 bp片段克隆至pGBKT7载体中，获得诱饵载体pGBKT7-OsCRK5，经测序无误后，转化至酵母菌株Y2H Gold中。在营养缺陷培养基中观察到重组蛋白不具有毒性作用及自激活活性，同时利用Western blot分析重组蛋白的表达。进一步利用水稻cDNA文库筛选OsCRK5的互作蛋白，共得到77个阳性克隆。功能预测结果显示，互作蛋白涉及蛋白质合成、贮存和降解过程、转录调控、植物细胞生长和分裂过程、能量代谢和细胞代谢等方面的功能。最后，从阳性克隆中选取参与植物干旱胁迫应答的两个蛋白OsWR1和OsDi19-1，利用酵母双杂交和双分子荧光互补的方法验证其与OsCRK5的相互作用。研究结果为水稻抗旱的遗传改良奠定了基础。
关键词： 水稻 OsCRK5 酵母双杂交 cDNA文库 干旱胁迫
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本氏烟中与番茄斑萎病毒N蛋白互作的寄主因子的筛选
《福建农业学报 》 2021 CSCD
摘要：【目的】番茄斑萎病毒（Tomato spotted wilt virus, TSWV）是植物多分体负义链RNA病毒的代表性成员。TSWV的N蛋白在病毒感染的寄主植物内表达量高,可能调控病毒对寄主的感病,探究N蛋白通过影响哪些寄主蛋白的表达来完成病毒的侵染,以期为深入解析寄主蛋白调控病毒的分子机制提供理论基础,为后续有效的防控TSWV提供新的思路。【方法】以TSWV N蛋白作为诱饵蛋白,采用酵母双杂交（Yeast two-hybrid, Y2H）的方法筛选本氏烟内与TSWV N相互作用的寄主蛋白。【结果】共筛选获得15种与TSWV N相互作用的寄主蛋白。【结论】这些介体因子主要参与色素的生物合成、类囊体膜的组装、植物防御反应和核糖体生物发生的过程,调节脂质代谢和细胞功能,可能是翻译调控的辅助蛋白,在植物发育和对非生物胁迫的反应中发挥着重要作用。
关键词： 番茄斑萎病毒（TSWV） N蛋白 酵母双杂交 寄主蛋白
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利用酵母双杂交技术筛选鉴定与番茄环纹斑点病毒NSs蛋白互作的西花蓟马蛋白
《昆虫学报 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：[目的]筛选鉴定西花蓟马Franiklinella ocicdentalis体内与番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus, TZSV)NSs蛋白互作的介体因子.[方法]利用酵母双杂交技术筛选与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白;进行序列分析鉴定后,将捕获的蛋白与NSs基因回转到酵母细胞,利用营养缺陷型培养基鉴定蛋白互作情况.再利用GST Pull-down技术验证TZSV NSs与鉴定出的西花蓟马蛋白的体外互作关系.[结果]构建了TZSV NSs的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-NSs,确定了诱饵质粒对酵母AH109细胞无毒性,并且无自激活活性.序列分析发现与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白为类电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like, VDAC).酵母回转实验显示TZSV NSs与西花蓟马VDAC在酵母细胞内存在特异性互作.GST Pull-down结果表明TZSV NSs与西花蓟马VDAC在体外存在相互作用.[结论]通过酵母双杂交和GST Pull-down技术,分别在酵母细胞内和体外证实了TZSV NSs和西花蓟马VDAC存在特异性互作.这些结果有助于揭示西花蓟马VDAC蛋白调控西花蓟马持久传毒的机制,为虫传病毒病的防治提供理论基础.
关键词： 西花蓟马 酵母双杂交 番茄环纹斑点病毒 NSs蛋白 VDAC
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白背飞虱中肠内与SRBSDV P6蛋白互作的介体因子鉴定
《农业生物技术学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：南方水稻黑条矮缩病毒(Southern rice black-streaked dwarf virus, SRBSDV)由白背飞虱(Sogatella furcifera)以持久增殖型方式进行传播。该病毒能够在白背飞虱体内大量增殖并使昆虫终生带毒,是因病毒在介体昆虫内能够诱导形成病毒复制工厂-病毒原质所致。SRBSDV病毒原质主要由病毒编码的P5、P6和P9-1 3个非结构蛋白及其介体因子参与形成。其中,P6蛋白分别和P5、P9-1蛋白及其介体因子相互作用,在病毒原质形成过程中发挥重要作用。为了揭示哪些介体因子参与调控SRBSDV在昆虫体内的增殖过程,本实验利用酵母双杂交技术,将SRBSDV P6基因构建到酵母诱饵表达载体pGBKT7上,并转化酵母感受态细胞Y2HGold,Western blot分析显示P6蛋白在酵母感受态细胞内成功表达,表达的P6蛋白对细胞无毒性和自激活活性。本研究以携带SRBSDV的白背飞虱中肠cDNA文库为筛选对象,初探介体昆虫内与SRBSDV P6蛋白相互作用的蛋白。在酵母Y2HGold细胞内经大量筛选和回转验证,最终获得5个可能与P6蛋白互作的介体因子。这些介体因子主要参与基因的转录、蛋白质翻译、蛋白翻译后修饰和蛋白质的合成过程。本实验为深入解析介体因子调控病毒的复制过程和白背飞虱高效传播病毒的分子机制提供了理论基础。
关键词： 南方水稻黑条矮缩病毒(SRBSDV) P6蛋白 酵母双杂交 介体蛋白
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水稻穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库的构建
《基因组学与应用生物学 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：利用cDNA文库筛选与已知功能蛋白质互作蛋白质,是研究蛋白质之间相互作用的重要途径之一。本试验利用水稻武运粳7号(95-22)穗为材料,构建了一个穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库,试验表明,本实验构建的cDNA初级文库容量和目的文库容量分别为1.44×107 CFU/mL和9.6×106 CFU/mL,重组率均为95%;初级文库插入片段长度介于500～2 000 bp之间,目的文库插入片段长度介于1 000～2 000 bp之间,两者平均插入片段长度均在1 000 bp以上;通过NCBI数据库、RicexPro数据库和Rice Genome Annotiation Project数据库对目的文库中的19个单克隆测序分析得知,19个克隆测序序列匹配17个相应的基因,文库重复率为10.5%,其中16个基因均在穗部有表达。以上试验表明,本实验构建的cDNA文库是一个质量较高的文库,可以直接用于穗发育相关基因筛选。
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小粒野生稻酵母双杂交cDNA文库的构建
《杂交水稻 》 2010 北大核心 CSCD
摘要：采用酵母双杂交系统,利用SMART技术,在酵母菌株AH109中构建了小粒野生稻全长cDNA文库,文库容量约为1×106,插入片段平均大小约为640bp。该文库可以用于进一步的酵母双杂交筛选。
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