科研产出
利用酵母双杂交系统筛选水稻中与OsCRK5互作蛋白
《生物技术通报 》 2023 北大核心 CSCD
摘要：水稻是重要的粮食作物，研究水稻生长发育调控机制可为水稻品种改良奠定理论基础。钙依赖蛋白激酶（calcium dependent protein kinases, CDPKs）是植物中重要的蛋白激酶，参与植物生长发育以及对环境反应的应答。水稻中的CRK5（CDPKrelated kinase 5）在蛋白序列和结构上与CDPK高度同源。为进一步研究OsCRK5在水稻干旱反应中的功能，本研究利用酵母双杂交筛库技术筛选了OsCRK5的互作蛋白。首先将OsCRK5的1-1 332 bp片段克隆至pGBKT7载体中，获得诱饵载体pGBKT7-OsCRK5，经测序无误后，转化至酵母菌株Y2H Gold中。在营养缺陷培养基中观察到重组蛋白不具有毒性作用及自激活活性，同时利用Western blot分析重组蛋白的表达。进一步利用水稻cDNA文库筛选OsCRK5的互作蛋白，共得到77个阳性克隆。功能预测结果显示，互作蛋白涉及蛋白质合成、贮存和降解过程、转录调控、植物细胞生长和分裂过程、能量代谢和细胞代谢等方面的功能。最后，从阳性克隆中选取参与植物干旱胁迫应答的两个蛋白OsWR1和OsDi19-1，利用酵母双杂交和双分子荧光互补的方法验证其与OsCRK5的相互作用。研究结果为水稻抗旱的遗传改良奠定了基础。
关键词： 水稻 OsCRK5 酵母双杂交 cDNA文库 干旱胁迫
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水稻穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库的构建
《基因组学与应用生物学 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：利用cDNA文库筛选与已知功能蛋白质互作蛋白质,是研究蛋白质之间相互作用的重要途径之一。本试验利用水稻武运粳7号(95-22)穗为材料,构建了一个穗发育相关基因酵母双杂交cDNA文库,试验表明,本实验构建的cDNA初级文库容量和目的文库容量分别为1.44×107 CFU/mL和9.6×106 CFU/mL,重组率均为95%;初级文库插入片段长度介于500～2 000 bp之间,目的文库插入片段长度介于1 000～2 000 bp之间,两者平均插入片段长度均在1 000 bp以上;通过NCBI数据库、RicexPro数据库和Rice Genome Annotiation Project数据库对目的文库中的19个单克隆测序分析得知,19个克隆测序序列匹配17个相应的基因,文库重复率为10.5%,其中16个基因均在穗部有表达。以上试验表明,本实验构建的cDNA文库是一个质量较高的文库,可以直接用于穗发育相关基因筛选。
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菰均一化全长cDNA文库的构建
《湖南农业科学 》 2017
摘要：为了获得国家二级保护植物品种菰的功能基因信息,并克隆功能基因片段,研究以SMART(switching mechanism at 5 end of RNA transcript)方式合成菰全长cDNA,结合DSN(duplex-specific nuclease)均一化技术,构建菰叶片组织的均一化全长cDNA文库。该cDNA文库库容量大,达到了3.6×10~6 PFU/m L,插入片段平均长度为1 000 bp,重组率为97.9%。均一化全长cDNA文库能有效富集低丰度表达基因,降低冗余率,适用于目的基因的筛选,以及后续的基因、蛋白互作分析。
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