科研产出
利用CRISPR/Cas9技术创制镉低积累香型水稻
《杂交水稻 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：尝试利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对镉吸收转运基因OsNramp5和香味基因OsBadh2同时进行编辑,培育出后代性状稳定的优质低镉水稻品种。选用华南地区推广面积较大的常规稻华航31为受体材料,通过CRISPR/Cas9技术创制OsNramp5和OsBadh2双基因敲除植株,在镉污染土壤中种植并测定野生型和双基因敲除植株糙米的镉、锰、铁元素含量以及香味物质2-乙酰-1-吡咯啉（2-AP）的含量,并考察野生型与双基因敲除植株的农艺性状。成功获得了5种类型的华航31双基因敲除植株。与野生型华航31相比,大部分双基因敲除植株的镉和锰含量显著下降,铁含量有一定程度的升高;所有双基因敲除植株中的香味物质2-AP含量均显著提高;大部分双基因敲除植株的株高、每穗实粒数显著下降;全部双基因敲除植株的单株有效穗数、每穗总粒数、结实率均无显著变化。通过CRISPR/Cas9技术可快速创制具有镉低积累和香味的水稻种质,有利于加快优质、安全水稻品种的育种进程。
关键词： 水稻 镉 香味 基因编辑 CRISPR/Cas9技术 育种
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OsYABBY4基因调控水稻株高的功能研究
《杂交水稻 》 2021 北大核心 CSCD
摘要：株高是影响水稻产量、光合速率、抗倒性的重要农艺性状,赤霉素对株高形成具有重要调控作用。YABBY家族基因作为植物特有的转录因子,参与GA信号途径,调控水稻株高。通过CRISPR/Cas9技术定向突变了OsYABBY4基因,成功创制了3种不同突变类型的osyabby4突变体。表型分析发现,osyabby4突变体结实率下降,倒1和倒2节间的伸长受到抑制,导致株高显著降低。α-淀粉酶诱导及赤霉素相关基因差异表达实验表明,OsYABBY4通过参与GA信号转导调控水稻的株高。本研究为水稻理想株型育种提供了新材料,同时进一步完善了水稻株高分子调控网络。
关键词： 水稻 OsYABBY4基因 株高 赤霉素 CRISPR/Cas9技术
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利用CRISPR/Cas9基因编辑技术获得水稻GRAS家族转录因子G540突变体
《分子植物育种 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：GRAS转录因子是植物特有转录因子,一般由保守的GRAS结构域组成,与光信号转导、赤霉素信号转导、植物生长发育及植物逆境胁迫响应密切相关.水稻GRAS转录因子G540中含有2个RPT1结构域和2个GRAS结构域,系统进化分析和表达模式分析发现,G540属于GRAS转录因子家族中的HAM亚家族,在水稻穗早期发育阶段特异表达,推断G540可能参与穗的早期分化或形态建成.本研究利用CRISPR/Cas9技术对G540进行定点编辑,构建G540基因敲除载体并利用农杆菌介导转化水稻粳稻品种'9522',鉴定并获得遗传转化植株.对转化植株的靶序列进行分析发现,9522G540-1在靶序列上缺失了第4位C碱基,9522G540-4在靶序列的第3位和第4位之间插入了一个A碱基,9522G540-2在G540的双等位基因上出现了不同的突变,一条链在靶序列上缺失了第4位C碱基,另一条链在靶序列上缺失8个碱基.对G540突变后的氨基酸序列分析发现,9522G540-1、9522G540-2和9522G540-4的RPT1和GRAS结构域完全缺失,即成功获得以'9522'为背景的G540功能缺陷型突变体.为进一步探究该基因在穗发育进程中的生物学功能和分子机制提供遗传材料.
关键词： 水稻 转录因子 GRAS家族 CRISPR/Cas9
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CRISPR/Cas9技术在作物中的研究及应用进展
《作物研究 》 2020
摘要：基因组编辑技术可在基因组水平上精准而高效地修饰植物的DNA序列,其通过使用序列特异核酸酶在靶位点产生DNA双链断裂,激活细胞内两种DNA损伤修复途径:非同源末端连接及同源重组,从而实现精确的基因组编辑,其中CRISPR/Cas9技术在各种动植物、微生物中得到了广泛地应用.从CRISPR/Cas系统的基本概况、优化及其在作物中的应用等方面进行详细地阐述,并对其在未来需要改善的地方进行了探讨和展望.
关键词： 作物 基因组编辑 CRISPR/Cas9技术
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水稻抽穗期基因OsDof6功能的初步研究
《中国水稻科学 》 2020 北大核心 CSCD
摘要：[目的]以前期通过穗发育芯片筛选到一个水稻Dof家族转录因子OsDof6为研究对象,进一步探究OsDof6的表达模式与生物学功能.[方法]对OsDof6的基因、蛋白及启动子序列进行生物信息学分析,利用CRISPR/Cas9技术对该基因进行定点编辑,通过实时定量PCR和亚细胞定位技术分析该基因的表达模式.[结果]对该基因的启动子序列分析表明,该基因启动子中存在大量与光响应、激素响应及胁迫响应相关的顺式调控元件.利用CRISPR/Cas9技术获得了2种不同突变类型的功能缺失突变体9522Dof6-3和9522Dof6-4.对突变体T1株系进行表型观察发现,相较于对照,两种突变体在营养生长阶段分蘖数明显降低,转入生殖生长阶段后,两种突变体的抽穗时间推迟约3 d.实时定量PCR结果显示OsDof6在水稻根、茎、叶和穗中均有不同程度的表达,在穗发育后期相对表达量明显提高;通过亚细胞定位分析发现OsDof6定位于细胞核.[结论]初步判断OsDof6基因会影响水稻分蘖数与抽穗期.
关键词： 水稻 Dof家族 抽穗期 CRISPR/Cas9
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利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术定向降低水稻落粒性
《中国农业科学 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段——CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLg RNA-U3、pYLg RNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-g RNA、U6a-qSH1T1-g RNA表达盒,最后将2个g RNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T0代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T0代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T0代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T1代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T1代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T2代qsh1纯合突变系群体(17SZ01和17SZ02)。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。
关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑 水稻 qSH1 落粒性
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水稻穗发育基因OsD1功能的初步分析
《杂交水稻 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术对一个水稻穗发育相关基因OsD1进行了定点编辑。通过定点编辑载体的构建、水稻愈伤组织的转化、转基因植株的鉴定及突变类型的分析,获得了4株OsD1功能缺失型突变体,其中2株属于纯合突变类型。表型分析发现,OsD1突变体的内外稃出现显著的畸形发育,花粉粒的淀粉充实度降低且颖花不结实,初步推断水稻OsD1基因可能参与花器官的建成和发育。
关键词： 水稻 CRISPR/Cas9 基因编辑 穗发育 OsD1
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CRISPR/Cas9介导基因组编辑培育糯稻不育系WX209A
《基因组学与应用生物学 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：糯稻作为特种稻米每年在我国和广西都有一定比例的消费,为了培育高产糯稻品种,本研究利用CRISPR/Cas9介导基因组编辑技术将高产的非糯性品种转为糯性品种,对水稻优良保持系209B中的W_x位点进行定点编辑,并转育成糯稻不育系WX209A。209A又名银丰A,是优良籼稻不育系,已组配出一批水稻品种在广西、广东、江西等地进行大面积推广。本研究针对该保持系的Wx基因选择合适的靶位点,构建sgRNA表达盒与 YLCRISPR/Cas9载体连接,利用农杆菌介导转化209B;对T_0、T_1代转化植株定点编辑位置进行PCR检测和测序分析及测定转化植株精米直链淀粉含量,筛选出无外源转化原件的纯合保持系WX209B并转育出不育系WX209A。结果表明,T_0代材料中Wx位点的突变频率高达69.2%,其中纯合缺失突变率占26.9%;对T_1代纯合突变体的调查分析结果表明,多数W_x基因突变体能显著降低直链淀粉含量,所获得的糯稻保持系WX209B直链淀粉含量仅1%,糯性品质优良,其他形态、经济性状没发生显著的改变,所转育的糯稻不育系WX209A具有重要的利用价值。
关键词： 糯稻 CRISPR/Cas9 基因组编辑育种 Wx位点 WX209A
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CRISPR/Cas9定点编辑水稻穗发育Osa1基因
《杂交水稻 》 2017 北大核心 CSCD
摘要：CRISPR/Cas9是一种快速发展的基因组定点编辑技术。利用该技术对水稻穗发育基因Osa1进行定点编辑,精准敲除Osa1基因,获得Osa1功能缺失突变体,为Osa1基因功能的深入研究提供了准确可靠的突变体材料。
关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑技术 水稻穗发育 Osa1基因
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基于基因组编辑技术的水稻靶向突变特征及遗传分析
《遗传 》 2016 北大核心 CSCD
摘要：TALEN(Transcription activator-like effector nucleases)系统和CRISPR/Cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR-associated protein 9)系统是当前广泛应用的两大基因组编辑技术。本文比较分析了水稻(Oryza sativa L.)中这两大系统诱导突变的突变率、突变类型、突变位置、突变时间和遗传模式,发现TALEN系统和CRISPR/Cas9系统均可在T_0代水稻中有效诱发位点特异性突变,且CRISPR/Cas9的突变率更高。两大系统都以诱发10 bp以内的In Del突变为主,TALEN系统易诱导10 bp以内的缺失突变,而CRISPR/Cas9系统易诱导1 bp的插入突变,且CRISPR/Cas9系统诱发的DNA双链断裂(Double-strand breaks,DSBs)位置更加精确。此外,DSBs在修复过程中能以低频同源重组(Homologous recombination,HR)途径修复,产生DNA片段重复突变。对于相邻双靶点CRISPR/Cas9系统而言,双靶点间的DNA片段可发生缺失或倒位,这种双靶点间DNA片段突变的发生频率与双靶点各自的突变率无正相关性。两大系统诱导的突变最早发生在已转化的愈伤组织中,少量发生在水稻的体细胞中,导致了纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变4种遗传模式,其中双等位突变比例最高,嵌合突变比例最低。除嵌合突变外,纯合突变、杂合突变、双等位突变的突变序列均可稳定遗传给下一代。
关键词： TALEN CRISPR/Cas9 水稻 靶向突变 遗传特性
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