科研产出
利用CRISPR/Cas9技术创制水稻落粒性基因qSH1突变体及突变特征分析
《农业生物技术学报 》 2019 北大核心 CSCD
摘要：落粒性是与水稻(Oryza sativa)生产密切相关的重要农艺性状之一,落粒性过强既不利于稻谷收获,也不适于水稻的机械化生产。落粒性基因qSH1 (QTL of seed shattering in chromosome 1;LOC_Os01g62920)是控制水稻落粒性的主效基因之一,其在小穗离层区域(abscission zone, AZ)的表达促进了离层结构形成,最终导致落粒性形成。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑系统,在qSH1的编码区起始密码子附近及位于其开放阅读框12 kb处5'端调控区的一个关键SNP位点设计5个靶位点,构建3个不同的CRISPR/Cas9植物表达载体,转化受q SH1基因主效调控的易落粒大穗型籼稻(Oryza sativa ssp.indica)品种HR1128。经PCR检测鉴定,获得了31株T0代转基因阳性植株。对其靶位点PCR扩增及测序分析发现,3个不同的表达载体的突变效率分别为85.71%、76.92%、63.64%。选择10个T0代突变植株深入分析靶位点突变特征,发现靶位点的突变类型包括了碱基缺失、碱基插入及碱基替换等类型,突变基因型包括了纯合突变、杂合突变、双等位突变及嵌合突变4种模式。进一步预测并分析了编码区和调控区靶位点突变所引起的效应发现,编码区靶位点突变引发移码突变,从而导致氨基酸翻译的提前终止;而调控区靶位点突变可能影响ABI3 (abscisic acid insensitive3)型转录因子的结合,使得qSH1基因的转录表达异常。本研究成功实现了对水稻q SH1基因及其调控区的定点编辑,获得了一系列不同类型的T0代突变植株,并对其突变特征进行了统计分析,为进一步分析、挖掘qSH1基因新功能及关键调控位点、培育落粒性适中的水稻新品种提供了理论依据和材料基础。
关键词： CRISPR/Cas9系统 落粒性 qSH1 突变特征
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利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术定向降低水稻落粒性
《中国农业科学 》 2018 北大核心 CSCD
摘要：【目的】易落粒既不利于稻谷收获,也不适宜于水稻机械化生产。利用现阶段前沿的分子育种手段——CRISPR/Cas9技术对水稻落粒性主效基因qSH1进行定点编辑,并调查分析易落粒性状的改良效果,为创制稳产和适合机械化生产的水稻新种质奠定材料基础和探索新途径。【方法】以qSH1为靶标基因,根据CRISPR/Cas9技术原理设计靶标位点。将所设计的靶点序列在水稻参考基因组中比对分析以排除非特异性靶位点,最终筛选出qSH1-T1和qSH1-T5靶标位点。化学合成靶位点寡核苷酸序列,退火后分别与pYLg RNA-U3、pYLg RNA-U6a载体连接构建U3-qSH1T5-g RNA、U6a-qSH1T1-g RNA表达盒,最后将2个g RNA表达盒同时连接至pYLCRISPR/Cas9表达载体中,构建pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51表达载体。利用农杆菌介导转化易落粒的籼稻品种HR1128,以潮霉素抗性为筛选标记筛选获得T0代转基因阳性植株。利用靶位点扩增测序法判断T0代转基因植株在预期靶标位点是否发生突变,并进一步分析突变类型及基因型。将靶点序列在水稻参考基因组中比对,选择与靶点序列匹配度大于或等于15 bp且3′端具有NGG的位点作为潜在脱靶位点进行脱靶效应评估。利用潮霉素基因及靶点检测进一步筛选无T-DNA成分的qsh1突变植株并进一步构建qsh1突变系,并分析qsh1突变系的落粒性、qSH1的表达量及预测编码氨基酸序列。【结果】pYLCRISPR/Cas9-qSH1-T51载体成功地实现了对qSH1靶标位点的定点编辑。在T0代转基因阳性植株中获得7个突变单株,其中qSH1-T1和qSH1-T5靶点的突变频率分别为54.55%和63.64%,突变基因型包括纯合突变、杂合突变、双等位突变和嵌合突变,突变类型包括碱基插入、碱基缺失及碱基突变。通过对T1代植株进行潮霉素基因筛选、靶位点扩增测序,结果表明,在T1代植株中Cas9载体骨架和qSH1突变位点都发生了分离,获得2种不含T-DNA成分的qsh1纯合突变株,并以此构建2个T2代qsh1纯合突变系群体(17SZ01和17SZ02)。对46株转基因阳性植株进行脱靶效应分析,发现3个潜在脱靶位点均未发生突变,表明所设计的靶标位点具有较高的特异性。通过落粒性测定分析表明,与野生型对照相比,2个qsh1纯合突变系的落粒性显著降低。进一步分析发现,2个突变系氨基酸翻译均发生改变并提前终止,同时17SZ01突变系qSH1的表达量显著降低。【结论】利用CRISPR/Cas9技术对水稻基因组进行定点编辑定向改良水稻品种落粒性,是一条高效、安全的分子改良育种策略。
关键词： CRISPR/Cas9 基因编辑 水稻 qSH1 落粒性
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